62/2000 Защитите здоровье младенцев и маленьких детей! Ионообменная хроматография Wanyi определяет семь типов человеческого молока

Преамбула

Олигосахариды человеческого молока (HMO) - это группа олигосахаридов с степенью полимеризации не выше 3, естественно присутствующих в человеческом молоке.они являются третьим по величине твердым компонентом в молоке человека.Они регулируют кишечную флору, особенно способствуя колонизации бифидобактерий в кишечнике младенцев, поддерживая при этом здоровье кишечника.поддержка иммунного и мозгового развитияПоскольку в 2015 году в Соединенных Штатах была запущена первая смесь для детей, обогащенная HMO,широкий ассортимент детской смесиПо состоянию на 1 июня 2023 года США и ЕС одобрили использование семи HMO:2'-фукозиллактоза, 3'-фукозиллактоза, дифукозиллактоза, лакто-Н-неоттетраоза, лакто-Н-тетраоза, 3'-сиалиллактоза и 6'-сиалиллактоза.

Среди распространенных методов обнаружения HMO жидкая хроматография требует реакции дериватизации перед обнаружением, включает сложную подготовку образцов, а реагенты дериватизации часто токсичны;теплоустойчивый характер HMO также приводит к низкой реакции и низкой повторяемости в LC-MSНапротив, ионная хроматография с амперметрическим обнаружением углеводов обеспечивает простоту подготовки образцов, высокую реакцию и хорошую повторяемость, что дает ей явные преимущества для анализа HMO.В данной примечании к применению используется рукоприготовленный гидроксид натрия, ацетата натрия и сверхчистой воды в качестве элюентов, и использует ионный хроматограф WAYEAL IC6300 для определения HMO в смеси для младенцев.высокая чувствительность и хорошая линейность, обеспечивающий полезную ссылку для обнаружения HMO в пищевых продуктах.

Ключевые слова: ионный хроматограф; олигосахариды человеческого молока; амперметрический детектор.

1Инструменты, оборудование и реагенты

1.1 Реагенты и стандарты

Таблица 1. Список реагентов и стандартов

1.2 Лабораторные материалы и вспомогательное оборудование

• 1.2.1 Аналитический баланс (читаемость 0,1 мг);
• 1.2.2 Термостатическая водная ванна;
• 1.2.3 центрифуга;
• 1.2.4 фильтры с мембранами полиэфирсульфонов (0,45 мкм);
• 1.2.5 сверхчистая вода;
• 1.2.6 устройство для фильтрации вакуума;
• 1.2.7 картриджей предварительной обработки для экстракции твердой фазы (SPE) RP;
• 1.2.8 Одноразовые шприцы (20 мл, 5 мл).

2Экспериментальный метод

2.1 Приготовление раствора

• 2.1.1 200 ммоль/л раствор гидроксида натрия: пипетка 10,5 мл 50% NaOH, разбавленная водой до 1000 мл и фильтрованная под вакуумом.
• 2.1.2 Смешанный раствор из 75 ммоль/л NaOH и 250 ммоль/л ацетата натрия: точно взвесить 20,51 г ацетата натрия, растворить в воде и перенести в 1000 мл объемную колбу; точно пипету 3.95 мл 50% NaOH, разбавить до 1000 мл сверхчистой водой и фильтровать под вакуумом.
• 2.1.3 3% раствор сульфосалициловой кислоты: взвесить 3,0 г сульфосалициловой кислоты, растворить в воде и развести до 100 мл (приготовить свежим).
• 2.1.4 Смешанный стандартный исходный раствор: точно взвесить по 5 мг 2'-фукозиллактозы, 3'-фукозиллактозы, 3'-сиалиллактозы, 6'-сиалиллактозы, лакто-Н-тетраозы и лакто-Н-неоттетраозы (до ближайшей точности 0.1 мг), поместить в 10 мл объемную колбу, растворить в воде и разбавить до отметки для приготовления смеси 500 мг/л. Отдельно взвесить 1 мг дифукозиллактозы (с точностью до 0,1 мг),поместить в емкостную колбу емкостью 10 мл, растворяют и разбавляют до отметки для приготовления 100 мг/л.
• 2.1.5 Смешанные стандартные рабочие растворы: точно пипетируйте смешанный раствор (21.4) в объемные колбы и разбавлять водой для приготовления смешанных рабочих растворов 2'-FL, 3'-FL, 3'-SL, 6'-SL, LNT, LNnT и DFL при 0.5, 2, 4, 6, 8 и 10 мг/л. Подготовить свежими перед употреблением.

2.2 Подготовка образцов

Весят примерно 2,0 г образца в маленькую чашку, тщательно перемешивают с 50 мл теплой воды (около 50 °C), добавляют 40 мл 3%-ного раствора сульфосалициловой кислоты,переносить и разбавить до 100 мл в объемной колбе, и ультразвуковое устройство в течение 10 мин. Фильтр через фильтрующую бумагу или центрифугу (12,000 р/мин, 15 мин). Провести образец раствора через RP SPE картридж, а затем 0,45 мкм водяной мембранный фильтр;избавиться от первых 3 мл и собрать элуат для анализаПеред использованием патрон RP SPE заправьте 20 мл метанола, затем 15 мл воды, и сбалансируйте в течение 30 минут.

2.3 Опытные условия

2.3.1 Условия ионной хроматографии

3Результаты.

3.1 Линейный диапазон

Была проанализирована соответствующая аликвота каждого смешанного стандартного рабочего раствора.отклонения между измеренными и номинальными концентрациями находились в пределах максимально допустимого отклонения, значения R2 были выше 0.999, и все компоненты показали хорошую линейность.

Таблица 2. Линейные диапазоны соединений

Рисунок 1. Наложенные калибровочные хроматограммы семи стандартов HMO

3.2 Результаты испытаний проб

Образцы 1 и 2 испытывались после десятикратного разбавления, содержание каждого из семи HMO рассчитывалось следующим образом: X - содержание в образце (мг/100 г);c - концентрация в растворе образца по кривой калибровки (мг/л); V - постоянный объем (mL); m - масса образца (g); f - коэффициент разбавления.

Рисунок 2. Ионная хроматограмма образца 1 разбавленная в 10 раз

Рисунок 3. Ионная хроматограмма пробы 2 разбавленная в 10 раз

Таблица 3. Результаты испытаний проб

3.3 Точность

Рабочий раствор на четвертом уровне калибровки был проанализирован в течение шести последовательных впрысков в условиях 2.3.1Для оценки повторяемости было рассчитано RSD семи HMO-содержаний.

3.3.1 Стандартная точность повторения

Результаты испытаний:

Рисунок 4. Наложенные хроматограммы независимых репликатов инъекций калибровочного стандарта S4

Таблица 4. Точность повторения стандарта

3.4 Границы обнаружения и количественного измерения

LOD: аликвоты стандартного раствора разбавляли до смешанного раствора, содержащего 10 μg/L 3'-FL, 30 μg/L DFL, 30 μg/L 2'-FL, 22 μg/L LNnT, 67 μg/L LNT, 67 μg/L 6'-SL и 160 μg/L 3'-SL;Было подготовлено и проанализировано 20 параллельных образцов..

LOQ: аликвоты стандартного раствора разбавляли до смешанного раствора, содержащего 30 μg/L 3'-FL, 80 μg/L DFL, 90 μg/L 2'-FL, 65 μg/L LNnT, 200 μg/L LNT, 200 μg/L 6'-SL и 500 μg/L 3'-SL;Было подготовлено и проанализировано шесть параллельных образцов..

Результаты испытаний следующие:

Таблица 5. Результаты S/N для LOD и LOQ семи HMO

3.5 Специфика

Аликвоты (100 мкЛ каждая) стандартных растворов глюкозы, фруктозы, сахарозы и мальтозы добавляли в объемную колбу объемом 10 мл и разбавляли до отметки, разбавляя раствор образца 2 в 67 раз.Раствор был проанализирован, чтобы проверить, не мешали ли эти сахара пикам семи HMOКак показано ниже, четыре сахара не оказывали значительного влияния на определение семи HMO в молочном порошке.

Рисунок 5. Наложенные хроматограммы калибровки S6, Образец 2 и Образец 2 с добавлением четырех стандартов сахара

4Заключение.

Для проверки метода определения HMOs в пищевых продуктах для этой проверки использовался ионный хроматограф WAYEAL. Данные показывают, что все хроматографические пики имеют хорошую форму без хвоста; 2'-FL, 3'-FL, DFL,LNnT, LNT, 6'-SL и 3'-SL элюируют в течение 60 минут; чувствительность соответствует требованиям национальных стандартов, а линейные коэффициенты корреляции все больше 0.999. Повторяемость как стандартов, так и образцов хороша. За исключением двух сиалиллактозов, LOD и LOQ находятся на уровне μg/L. Метод имеет хорошую специфичность, без обнаружения мешающих примеси,и в целом отвечает стандартным требованиям.