Определение афлатоксина В1, канцерогена группы 1, в масличных культурах системой Wayeal LCMS-TQ9200 LC-MS/MS

Афлатоксин Б₁представляет собой высокотоксичный вторичный метаболит, вырабатываемый преимущественно Аспергилл желтыйи Aspergillus parasiticus. Среди семейства афлатоксинов он проявляет наибольшую токсичность и самое широкое распространение. Он оказывает токсическое действие путем ингибирования внутриклеточного синтеза ДНК и РНК и нарушения белкового обмена, оказывая целенаправленное повреждающее воздействие на печень.По сравнению с другими микотоксинами, такими как охратоксин и патулин, афлатоксин B₁чрезвычайно токсичен и имеет хорошо доказанную канцерогенность. Он был классифицирован как Канцероген 1 группыВсемирной организацией здравоохранения (ВОЗ). Его часто обнаруживают в масличных культурах, таких как арахис, кукуруза, орехи и растительные масла, что делает его приоритетным загрязнителем для контроля безопасности пищевых продуктов во всем мире.

Загрязнение афлатоксином B₁Обычно возникает, когда масличные культуры подвергаются воздействию высоких температур и высокой влажности во время посадки, сбора урожая или хранения, что способствует росту грибков. Более того, благодаря своим стабильным химическим свойствам афлатоксин B₁не могут быть уничтожены обычными температурами приготовления, что приводит к повторяющимся проблемам с остатками в сельскохозяйственных продуктах и ​​обработанных пищевых продуктах.

Кратковременный прием высокой дозы может вызвать острое отравление, проявляющееся такими симптомами, как сильная боль в животе, рвота, желтуха и печеночная недостаточность, что в тяжелых случаях может привести к летальному исходу. Длительное воздействие низких доз приводит к накоплению в печени, вызывая хронические поражения печени, такие как фиброз печени и цирроз, и может даже спровоцировать первичный рак печени. Группы населения с более низким иммунитетом, включая детей, пожилых людей и людей с ранее существовавшими заболеваниями печени, подвергаются более высокому риску заражения афлатоксином B.₁отравление.

В Китае национальный стандарт GB 2761-2017 (Национальный стандарт безопасности пищевых продуктов – Максимальные уровни микотоксинов в пищевых продуктах) определяет максимальные пределы остатков афлатоксина B.₁в различных видах пищи. Кроме того, GB 5009.22-2016 (Национальный стандарт безопасности пищевых продуктов – Определение афлатоксинов B и G в пищевых продуктах)предоставляет официальные аналитические методы определения афлатоксина B.₁.

В этом примечании по применению описывается создание метода жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией с изотопным разбавлением (ЖХ-МС/МС) для определения афлатоксина B.₁с использованием системы ЖХ-МС/МС Wayeal LCMS-TQ9200.

Ключевые слова:Тройной квадруполь; Афлатоксин Б₁; Жидкостная хроматография с изотопным разбавлением-тандемная масс-спектрометрия.

1. Инструмент и реагенты

1.1 Конфигурация прибора

Таблица 1. Список конфигурации прибора

1.2 Реагенты и стандарты

Таблица 2. Реагенты и стандарты

1.3 Экспериментальный материал и вспомогательное оборудование

Вихревой смеситель

Высокоскоростная центрифуга

Аналитический баланс

Центрифуга

Коллектор твердофазной экстракции (ТФЭ) (с вакуумным насосом)

Испаритель азота

Шейкер

2. Метод эксперимента

2.1 Приготовление раствора

2.1.1 Раствор ацетата аммония концентрацией 5 ммоль/л:Взвесьте 0,39 г ацетата аммония, растворите его в воде и доведите до 1000 мл. Хорошо перемешайте.

2.1.1 Метанол-ацетонитриловый раствор:Добавьте 100 мл ацетонитрила к 100 мл метанола, затем хорошо перемешайте.

2.2 Предварительная обработка проб

2.2.1 Извлечение пробы

Пропустите пшеничную муку через сито с отверстиями 2 мм. Взвесьте 5 г образца (с точностью до 0,01 г) и поместите его в центрифужную пробирку емкостью 50 мл. Добавить 100мкмл рабочего раствора внутреннего стандарта изотопа (100 нг/мл), перемешать на вортексе и дать постоять 30 мин. Добавьте 20 мл раствора метанол-вода (70+30, по объему), перемешайте на вортексе и встряхивайте на орбитальном шейкере в течение 20 минут. Центрифуга при 6000 об/мин в течение 10 мин. Соберите супернатант для последующего использования.

2.2.2 Очистка пробы

Аккуратно перенесите 4 мл супернатанта в контейнер, добавьте 23 мл 1% тритона Х-100 в PBS и хорошо перемешайте.

После того как исходная жидкость из иммуноаффинной колонки полностью стечет, перенесите указанный выше раствор образца в цилиндр шприца емкостью 50 мл. Отрегулируйте скорость потока так, чтобы раствор пробы равномерно проходил через колонку со скоростью 1–3 мл/мин. После того как раствор образца полностью стечет, добавьте 2 × 10 мл воды в цилиндр шприца и промойте иммуноаффинную колонку при постоянной скорости потока. После того, как вода стечет, высушите колонку с помощью вакуумного насоса.

Отсоедините вакуумную систему. Поместите градуированную пробирку объемом 10 мл под иммуноаффинную колонку, снимите цилиндр шприца емкостью 50 мл и добавьте 2 × 1 мл метанола для элюирования колонки с контролируемой скоростью потока 1–3 мл/мин. Затем снова высушите колонку с помощью вакуумного насоса. Соберите весь элюат в пробирку.Аккуратно выпаривайте элюат почти досуха в токе азота при температуре 50°С. Добавьте 1 мл исходной подвижной фазы, перемешайте на вортексе в течение 30 секунд, чтобы растворить остаток. Фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм и собирают фильтрат во флакон автосамплера для последующей инъекции.

2.3 Условия эксперимента

2.3.1 Метод жидкостной хроматографии

Колонка: C18, 1,7мкмм, 2,1×50 мм

Фаза подвижной фазы: А: метанол-ацетонитриловый раствор; Фаза B: раствор ацетата аммония 5 ммоль/л.

Скорость потока: 0,3 мл/мин.

Температура колонки: 40°С

Объем инъекции: 3 мкл

2.3.2 Метод масс-спектрометрии

Таблица 3. Параметры масс-спектрометрии соединений

Примечание. Звездочка (*) указывает количественный ион.

3. Результат эксперимента

3.1 Стандартная хроматограмма

Определение афлатоксина В₁и внутренний стандарт изотопа 13C17-афлатоксин B.₁было выполнено за 5 минут. Как показано на рисунке 1, оба аналита показали отличную форму пиков и удовлетворительные ответы, что соответствует требованиям экспериментального анализа.

Рис. 1. Хроматограммы афлатоксина В.₁и внутренний стандарт изотопа 13С17​-Афлатоксин Б₁

3.2 Линейный диапазон

Соответствующий объем исходного стандартного раствора и рабочего раствора внутреннего стандарта смешанного изотопа аккуратно переносили и разбавляли исходной подвижной фазой для приготовления серии стандартных рабочих растворов с афлатоксином B.₁концентрации 50, 20, 10, 5, 2, 1 и 0,5 нг/мл. Каждый раствор содержал внутренний стандарт изотопа в концентрации 2 нг/мл. С использованием этих стандартов строили калибровочную кривую. В линейном диапазоне 0,5–50 нг/мл и после коррекции с помощью 13C 17-афлатоксина B₁В качестве внутреннего стандарта отклонения между измеренным и номинальным содержанием афлатоксина B₁концентрации находились в пределах предельно допустимого отклонения. Коэффициент корреляции (R) превышал 0,999, что указывает на превосходную линейность.

Рис. 2. Стандартная кривая афлатоксина B.₁

3.3 Повторяемость

Стандартные растворы в трех концентрациях (1, 10 и 20 нг/мл) вводили шесть раз последовательно. Результаты показаны в таблице ниже. Относительные стандартные отклонения (RSD) времени удерживания и количества образцов для афлатоксина B.₁при низких, средних и высоких концентрациях находились в пределах 5%, что соответствовало требованиям эксперимента.

Таблица 4. Тест на повторяемость афлатоксина B₁в низких, средних и высоких концентрациях

3.4 Восстановление шипов

Афлатоксин Б₁В образец добавляли стандартный раствор для достижения конечной концентрации 5 нг/мл. Затем образец с добавками анализировали методом ЖХ-МС/МС. Средний результат шести последовательных инъекций составил 5,147 нг/мл при RSD 1,954%. Рассчитанная степень извлечения составила 102,94%, что соответствует требованиям эксперимента.

3.5 Пустой остаток

После непрерывного введения стандартного раствора с концентрацией 20 нг/мл затем вводили контрольный образец для оценки переноса. Как показано на рисунке 3, в холостом образце переноса обнаружено не было.

Рис. 3. Пустая хроматограмма соединения.

3.6 Пример теста

Афлатоксин Б₁не был обнаружен в образце А (рис. 4).

Рис. 4. Хроматограмма афлатоксина B.₁в образце А

4. Заключение

В данном исследовании метод жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии с изотопным разбавлением (ЖХ-МС/МС) использовался для определения афлатоксина B.₁была создана с использованием системы жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии Wayeal LCMS-TQ9200. Полученные данные показывают, что все хроматографические пики имеют хорошую форму без размытия. Чувствительность соответствует экспериментальным требованиям, а коэффициент корреляции (R) превышает 0,999, что соответствует критериям линейности. Повторяемость при низких, средних и высоких концентрациях находится в пределах 5%, а после ввода пробы высокой концентрации переноса в системе не наблюдается. Эти результаты показывают, что метод, оснащенный системой жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии Wayeal, соответствует требованиям для рутинного качественного и количественного анализа целевых образцов.