Определение остатков β-агонистов в свинине с использованием системы жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии Wayeal LCMS-TQ9200

Данный эксперимент относится к стандарту "GB 31658.22-2022 Национальный стандарт безопасности пищевых продуктов — Определение остатков β-агонистов в пищевых продуктах животного происхождения методом жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии" и использует систему жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии Wayeal LCMS-TQ9200 для определения содержания β-агонистов в свинине. Результаты эксперимента показывают, что тест на пригодность системы продемонстрировал хорошо сформированные пики и хорошую линейность, что соответствует требованиям эксперимента. Повторяемость времени удерживания для стандартного рабочего раствора β-агонистов была ниже 1%, а повторяемость площади пика - менее 3%, что указывает на хорошую повторяемость. Для тестового раствора чувствительности β-агонистов отношения сигнал/шум основных пиков при концентрациях 0,2 нг/мл и 0,5 нг/мл были значительно больше 3 и 10 соответственно, что соответствует требованиям эксперимента.

В образце свинины при тестировании не обнаружено β-агонистов. Все вышеуказанные данные соответствуют требованиям к прибору, указанным в стандартном методе..

Ключевые слова:Жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия; β-агонисты; Кленбутерол; Безопасность пищевых продуктов.

1. Приборы и реагенты

1.1 Список конфигурации LCMS

Таблица 1 Список конфигурации прибора

1.2 Реагенты и стандарты

Таблица 2 Список реагентов и стандартов

1.3 Экспериментальный материал и вспомогательное оборудование

Ультразвуковой очиститель

Вихревой смеситель

Шейкер с термостатированием в водяной бане

Высокоскоростная центрифуга

2. Метод эксперимента

2.1 Подготовка образца

2.1.1 Ферментативный гидролиз и экстракция

Взвесьте 2 г образца (с точностью до ±0,05 г) в центрифужной пробирке объемом 50 мл. Добавьте 6 мл буферного раствора ацетата аммония 0,2 моль/л и 40 мкл β-глюкуронидазы/арилсульфатазы. Перемешайте на вортексе до однородности и инкубируйте при 37°C в темноте с перемешиванием в водяной бане в течение 16 часов. Дайте остыть до комнатной температуры для последующего использования.

2.1.2 Экстракция, очистка и концентрирование

Возьмите подготовленный раствор, добавьте 100 мкл рабочего раствора внутреннего стандарта 100 нг/мл, перемешайте на вортексе до однородности и центрифугируйте при 8000 об/мин в течение 8 минут. Соберите супернатант, добавьте 5 мл раствора хлорной кислоты 0,1 моль/л, перемешайте на вортексе и доведите pH до 1,0 ± 0,2 с помощью хлорной кислоты. После центрифугирования при 8000 об/мин в течение 8 минут доведите pH супернатанта до 10 ± 0,5 с помощью раствора гидроксида натрия 10 моль/л. Добавьте 15 мл этилацетата, встряхивайте со средней скоростью в течение 5 минут и центрифугируйте при 5000 об/мин в течение 5 минут. Соберите верхний органический слой. К оставшемуся водному слою добавьте 10 мл метил-трет-бутилового эфира, встряхивайте со средней скоростью в течение 5 минут, центрифугируйте при 5000 об/мин в течение 5 минут и соберите верхний органический слой. Объедините все органические слои и выпарите досуха в потоке азота при 50°C. Растворите остаток в 5 мл раствора муравьиной кислоты 2% и отложите в сторону. Подготовьте колонку для твердофазной экстракции смешанного режима, последовательно активируя ее 3 мл метанола и 3 мл муравьиной кислоты 2%. Загрузите подготовленный раствор на колонку, последовательно промойте 3 мл муравьиной кислоты 2% и 3 мл метанола и высушите под вакуумом. Элюируйте колонку 3 мл раствора аммонированного метанола 5%. Выпарите элюат досуха в потоке азота при 50°C. Растворите остаток в 0,5 мл раствора метанол–0,1% муравьиной кислоты (10:90, об/об), тщательно перемешайте и отфильтруйте через микропористую мембрану 0,22 мкм для анализа методом жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии.

2.2 Условия эксперимента

2.2.1 Условия жидкостной хроматографии

Хроматографическая колонка: C18, 1,8 мкм 2,1*100 мм

Подвижная фаза: A: 0,1% муравьиной кислоты в воде; B: Метанол

Скорость потока: 0,3 мл/мин

Температура колонки: 40°C

Объем инъекции: 3 мкл

3. Тест на пригодность системы

Тест на пригодность системы показывает, что целевые пики хорошо сформированы, без помех от других пиков примесей, что соответствует требованиям эксперимента.

Рис. 1 Хроматограмма теста семи β-агонистов (1 нг/мл)

3.2 Линейный диапазон

Взяв стандартные растворы β-агонистов и используя рабочие растворы промежуточной концентрации, была подготовлена ступенчатая калибровочная кривая. Линейный диапазон для семи β-агонистов составлял 0,5–50 нг/мл, с R² > 0,99, что указывает на хорошую линейную зависимость.

Таблица 3 Таблица линейных диапазонов для β-агонистов

Рис. 2 Хроматограмма калибровочной кривой семи β-агонистов

3.3 Предел обнаружения (LOD) и предел количественного определения (LOQ)

В этом методе предел обнаружения (LOD) и предел количественного определения (LOQ) для β-агонистов установлены на уровне 0,2 нг/мл и 0,5 нг/мл соответственно. Для каждого соединения в этом методе отношение сигнал/шум при указанных концентрациях для LOD и LOQ больше 3 и 10 соответственно, что соответствует требованиям экспериментальной чувствительности.

Таблица 4 Соответствующие отношения сигнал/шум для LOD и LOQ каждого соединения

Рис. 3 Ионные хроматограммы семи β-агонистов при концентрации LOD и LOQ

3.4 Тест на прецизионность

Была взята смешанная смесь стандартных веществ β-агонистов при низких, средних и высоких концентрациях и последовательно введена шесть раз для сравнения отклонений времени удерживания и площади пика. Результаты показаны в таблице ниже. Все β-агонисты показали отклонения времени удерживания менее 1% и отклонения площади пика менее 3%, что соответствует требованиям эксперимента.

Таблица 5 Тест на прецизионность для каждого соединения

Рис. 4 Хроматограммы тестирования прецизионности семи β-агонистов (6 инъекций)

3.5 Тест образца

Образцы свинины, приобретенные на рынке, были протестированы в соответствии с упомянутым методом предварительной обработки, и β-агонисты не были обнаружены. Хроматографические пики не наблюдались во времена удерживания, соответствующие семи β-агонистам, в то время как другие пики представляют собой сигналы матрицы после ферментативного гидролиза.

Рис. 5 Хроматограмма теста образца свинины

4. Заключение

В этом методе используется система жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии Wayeal LCMS-TQ9200 для определения β-агонистов в свинине. Данные показывают, что все хроматографические пики имеют хорошую форму без хвостов, чувствительность соответствует требованиям эксперимента, коэффициенты линейной корреляции превышают 0,99, а прецизионность удовлетворительна с отклонениями времени удерживания ниже 1% и отклонениями площади пика в пределах 3% для шести последовательных инъекций каждого соединения. β-агонисты не были обнаружены в тестах образцов свинины. Эти результаты показывают, что метод, оснащенный системой Wayeal LC-MS/MS, соответствует требованиям рутинного качественного и количественного определения целевых аналитов.