Определение остатков эритромицина в остатках антибиотического ферментирования с использованием системы жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии Wayeal LCMS-TQ9200

Эритромицин - это макролидный антибиотик, получаемый путем ферментации Streptomyces erythreus. Он оказывает антибактериальное действие, главным образом, путем ингибирования синтеза бактериального белка. Производство эритромицина в основном основано на технологии биоферментации, включающей такие этапы, как отбор штаммов, посевная культура, крупномасштабная ферментация в резервуарах, экстракция и очистка. После ферментации эритромицин экстрагируют органическими растворителями (например, бутилацетатом), затем очищают путем кристаллизации или разделения на ионообменной смоле, в конечном итоге получая соли клинического качества (например, эритромицин этилсукцинат). Однако процесс производства эритромицина генерирует значительное количество мицелиальных отходов (остатков ферментации), которые могут содержать остатки антибиотиков, микробные белки и продукты метаболизма. При неправильном обращении эти остатки могут попасть в экологическую цепочку через сброс в окружающую среду или использование в качестве кормовых добавок, что приводит к множеству опасностей: Остаточный эритромицин может способствовать распространению генов устойчивости к антибиотикам в почве и водоемах, нарушая баланс микробного сообщества; усиленный через пищевую цепь, он может вызывать появление устойчивых штаммов бактерий у животных или людей, подрывая эффективность антибиотиков; кроме того, недостаточно используемое органическое вещество в остатках может вызывать загрязнение окружающей среды. Поэтому строгий контроль за мицелиальными остатками является критической мерой для борьбы с загрязнением от производства эритромицина.

Этот эксперимент был проведен со ссылкой на стандарт "T/PIAC 00003—2021 Групповой стандарт Китайской фармацевтической промышленной ассоциации - Метод определения эритромицина в остатках антибиотиков, материалах для органических удобрений, сельскохозяйственных культурах и окружающей среде", с использованием системы жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии Wayeal LCMS-TQ9200 для определения содержания эритромицина в мицелиальных отходах. Результаты эксперимента показывают, что тест на пригодность системы продемонстрировал хорошую форму пиков и хорошую линейность, что соответствует требованиям эксперимента.

1. Прибор и реагенты

1.1 Список конфигурации LCMS

Таблица 1 Список конфигурации прибора

1.2 Реагенты и стандарты

Таблица 2 Список реагентов и стандартов

1.3 Экспериментальный материал и вспомогательное оборудование

Ультразвуковая ванна

Вихревой смеситель

Высокоскоростная центрифуга

2. Метод эксперимента

2.1 Предварительная обработка образца

Взвесьте 0,5 г образца (с точностью до 0,001 г) в пробирку со стеклянной пробкой. Добавьте 50 мл ацетонитрила, перемешивайте на вортексе в течение 1 минуты для гомогенизации смеси и проведите ультразвуковую экстракцию в течение 20 минут. Затем перенесите смесь в центрифужную пробирку объемом 50 мл и центрифугируйте при 4000 об/мин в течение 10 минут. Соберите соответствующее количество супернатанта и пропустите его через фильтрующую мембрану 0,22 мкм. Отбросьте не менее 1 мл начального фильтрата, затем перенесите оставшийся фильтрат в янтарный флакон для ЖХ для анализа.

2.2 Условия эксперимента

2.2.1 Условия метода жидкостной хроматографии

Хроматографическая колонка: C18 1,7 мкм 2,1x50 мм

Подвижная фаза: A: Ацетонитрил, B: 0,1% муравьиной кислоты в воде

Скорость потока: 0,3 мл/мин

Температура колонки: 30℃

Объем инъекции: 2 мкл

2.2.2 Условия метода масс-спектрометрии

Таблица 3 Параметры источника ионов масс-спектрометрии

3. Результат эксперимента

3.1 Тест на пригодность системы

Результаты теста на пригодность системы показали четко определенные целевые пики без помех от посторонних пиков, что соответствует всем требованиям эксперимента.

Рис. 1 Хроматограмма стандартного рабочего раствора эритромицина А (0,5 нг/мл)

3.2 Линейный диапазон

Калибровочная кривая для эритромицина А была подготовлена путем последовательного разбавления стандартного раствора с использованием рабочих растворов промежуточной концентрации. Кривая продемонстрировала отличную линейность в диапазоне 0,5-500 нг/мл с коэффициентом корреляции (R²) более 0,99.

Таблица 4 Линейный диапазон эритромицина А

Рис. 2 Калибровочная кривая для эритромицина А

3.3 Предел обнаружения (LOD) и предел количественного определения (LOQ)

В этом методе предел обнаружения (LOD) и предел количественного определения (LOQ) для стандартного раствора эритромицина А были определены как 0,2 нг/мл и 0,5 нг/мл соответственно. Соответствующие отношения сигнал/шум (S/N) составили 110,02 и 292,20, что существенно превышает минимальные требования 3 и 10, тем самым выполняя критерии экспериментальной чувствительности.

Рисунок 3. Извлеченные ионные хроматограммы для LOD и LOQ эритромицина А

3.4 Тест на прецизионность

Раствор эритромицина А вводили последовательно семь раз, результаты показаны на рисунке ниже. Отклонение времени удерживания для эритромицина А составило 0,19%, а отклонение площади пика - 0,96%, оба из которых ниже 5%, что соответствует требованиям эксперимента.

Рисунок 4. Хроматограммы прецизионности образца эритромицина А (7 инъекций)

3.5 Тест образца

В соответствии с вышеупомянутым методом предварительной обработки, площадь целевого пика в твердом образце составила 7,4E6. Рассчитанное методом внешнего стандарта, содержание эритромицина А в растворе образца было определено как 400 нг/мл.

Рис. 5 Хроматограмма теста образца эритромицина А

4. Заключение

Этот метод использует систему жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии Wayeal LCMS-TQ9200 для определения содержания эритромицина А в остатках ферментации антибиотиков. Данные показывают, что метод демонстрирует отличные характеристики: все хроматографические пики имеют оптимальную форму без хвостов, а чувствительность соответствует требованиям эксперимента. Коэффициент линейной корреляции (R²) превышает 0,99. Отклонения времени удерживания и площади пика для всех соединений в семи последовательных инъекциях находятся в пределах 1%, что указывает на высокую точность. Хроматограммы образцов не показывают помех от посторонних пиков, а измеренное содержание образца составляет 400 нг/мл. Этот метод, оснащенный системой Wayeal LC-MS/MS, соответствует требованиям для рутинного качественного и количественного анализа тестовых образцов.