Определение гидроксианалога метионина в кормах с помощью высокопроизводительной жидкой хроматографии Wayeal

Гидроксианалог метионина (ГАМ) является органической кислотой, широко используемой в кормовой промышленности в качестве заменителя метионина. ГАМ широко применяется в кормах для птицы (бройлеров и несушек), свиней (поросят и откормочных свиней), жвачных животных (молочного и мясного крупного рогатого скота) и в аквакультуре (рыбы и креветки). В качестве заменителя метионина он демонстрирует значительные эффекты в снижении затрат на корм, улучшении кишечной среды животных и повышении иммунитета животных.

Высокоэффективная жидкостная хроматография в сочетании с УФ-детектированием хорошо подходит для анализа различных сложных кормовых образцов благодаря своей превосходной эффективности разделения, высокой устойчивости к интерференции матрицы, высокой чувствительности детектирования, а также стабильным и надежным количественным результатам. Данный эксперимент проводился в соответствии со стандартом «Определение гидроксианалога метионина в кормах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии» (GB/T 19371-2025). Для валидации процедуры пробоподготовки, системы жидкостной хроматографии и детектирования использовался высокоэффективный жидкостный хроматограф серии Wayeal LC3400, оснащенный УФ-детектором, что позволило проводить как качественное детектирование, так и точный количественный анализ гидроксианалога метионина в различных типах кормовых образцов.

Ключевые слова: корм; гидроксианалог метионина; высокоэффективная жидкостная хроматография.

1. Приборы и реагенты

1.1 Список конфигурации ВЭЖХ

Таблица 1 Список конфигурации системы высокоэффективной жидкостной хроматографии

1.2 Список реагентов и стандартных образцов

Таблица 2 Список реагентов и стандартных образцов

1.3 Условия жидкостной хроматографии

Таблица 3 Условия высокоэффективной жидкостной хроматографии

1.4 Экспериментальные материалы и вспомогательное оборудование

Ультразвуковая ванна;

Вортекс-миксер;

Высокоскоростная центрифуга;

Аналитические весы;

Шейкер.

2. Метод эксперимента

2.1 Приготовление растворов

2.1.1 Растворы для построения калибровочной кривой:

Точно взвесить соответствующее количество стандартного образца гидроксианалога метионина и растворить его в 10% ацетонитриле для приготовления серии стандартных растворов с массовыми концентрациями 0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10,0, 20,0, 40,0 и 80,0мкг/мл. Точно перенести по 5 мл каждого стандартного раствора в 15 мл пробирки с притертой пробкой. Точно добавить 0,1 мл 50% раствора гидроксида калия и перемешать на вортексе в течение 15 секунд. Затем точно добавить 0,2 мл 50% раствора фосфорной кислоты и снова перемешать на вортексе в течение 15 секунд. Центрифугировать при 8000 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость пропустить через микропористый мембранный фильтр перед анализом.

2.1.2 Растворы испытуемых образцов:

Взвесить 5 г кормовой пробы в емкость, добавить 50 мл 10% раствора ацетонитрила и перемешать в течение 30 секунд. Поместить на шейкер и встряхивать в течение 30 минут. Центрифугировать при 8000 об/мин в течение 5 минут и сохранить надосадочную жидкость для дальнейшего использования. Точно перенести 5 мл вышеуказанной надосадочной жидкости в 15 мл пробирки с притертой пробкой. Точно добавить 0,1 мл 50% раствора гидроксида калия и перемешать на вортексе в течение 15 секунд. Затем точно добавить 0,2 мл 50% раствора фосфорной кислоты и снова перемешать на вортексе в течение 15 секунд. Центрифугировать при 8000 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость пропустить через микропористый мембранный фильтр перед анализом. Приготовить два параллельных раствора испытуемых образцов.

2.1.3 Растворы для определения извлекаемости:

Точно перенести 2,5 мл надосадочной жидкости образца и 2,5 мл каждого стандартного раствора серии в 15 мл пробирки с притертой пробкой. Точно добавить 0,1 мл 50% раствора гидроксида калия и перемешать на вортексе в течение 15 секунд. Затем точно добавить 0,2 мл 50% раствора фосфорной кислоты и снова перемешать на вортексе в течение 15 секунд. Центрифугировать при 8000 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость пропустить через микропористый мембранный фильтр перед анализом.

3. Результаты эксперимента

3.1 Линейность и диапазон

Таблица 4 Таблица концентраций для построения калибровочной кривой

Рис. 1 Калибровочная кривая гидроксианалога метионина

Примечание: Были взяты соответствующие количества стандартного раствора гидроксианалога метионина и последовательно разбавлены до ряда концентраций для построения калибровочной кривой. Линейный диапазон составил 0,5—80,0 мкг/мл, а коэффициент корреляции (R) составил 0,99983, что указывает на отличную линейность аналита.

3.2 Прецизионность

Рис. 2 Наложенные хроматограммы теста на прецизионность для стандартного образца (20,0 мкг/мл)

Таблица 5 Данные теста на прецизионность для стандартного образца (20,0 мкг/мл)

Примечание: Стандартный образец гидроксианалога метионина (при концентрации 20,0мкг/мл) вводился непрерывно 6 раз. Повторяемость (относительное стандартное отклонение) времени удерживания составила 0,084%, а площади пика – 0,391%, что указывает на хорошую прецизионность прибора.

3.3 Извлекаемость

Рис. 3 Наложенные хроматограммы теста на извлекаемость гидроксианалога метионина из корма

Таблица 6 Данные теста на извлекаемость гидроксианалога метионина из корма

Примечание: Образец был обогащен стандартным образцом при концентрации 40,0мкг/мл и проанализирован по описанной выше процедуре. Полученная извлекаемость составила 88,56%, что указывает на хорошую точность метода.

3.4 Предел обнаружения (ПО)

Рис. 4 Хроматограмма стандартного образца гидроксианалога метионина (2,5мкг/мл)

Таблица 7 Данные теста для стандартного образца гидроксианалога метионина (2,5мкг/мл)

Примечание: На основе данных теста стандартного образца гидроксианалога метионина при концентрации 2,5 мкг/мл, приведенных в таблице выше, теоретический предел обнаружения (ПО) был рассчитан как 0,033 мкг/мл при соотношении сигнал/шум 3 (S/N = 3).

3.5 Анализ кормовой пробы

Рис. 5 Хроматограмма кормовой пробы

Примечание: Гидроксианалог метионина был обнаружен в кормовой пробе при концентрации 0,402мкг/мл.

4. Заключение

Данный эксперимент проводился в соответствии со стандартом «Определение гидроксианалога метионина в кормах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии» (GB/T 19371-2025) с использованием высокоэффективного жидкостного хроматографа серии Wayeal LC3400, оснащенного УФ-детектором. Результаты эксперимента показали, что целевой пик имел хорошую симметрию и высокое число теоретических тарелок. В диапазоне концентраций от 0,5—80,0мкг/мл коэффициент корреляции (R) превышал 0,9998. Значения относительного стандартного отклонения времени удерживания и площади пика стандартного образца ГАМ (20,0мкг/мл) составили 0,084% и 0,391% соответственно, что указывает на превосходную прецизионность прибора. Извлекаемость ГАМ из кормовых проб, обогащенных при концентрации 40,0мкг/мл, составила 88,56%, демонстрируя хорошую точность метода. Теоретический предел обнаружения (ПО) ГАМ был определен как 0,033мкг/мл. ГАМ был успешно обнаружен в кормовой пробе при концентрации 0,402мкг/мл. Все вышеуказанные данные соответствуют требованиям фармакопейного метода к характеристикам прибора.