Определение спектиномицина высокопроизводительным жидким хроматографом Wayeal с детектором ELSD

Детектор испарительного рассеяния света (ELSD) - это новый масс-детектор, теоретически применимый к любому соединению, способному образовывать газообразные частицы. В издании Фармакопеи 2025 года указано использование детекции испарительного рассеяния света (ELSD) для анализа и контроля качества более 100 видов лекарств. На практике ELSD чаще применяется к соединениям, не имеющим поглощения в ультрафиолетовом (УФ) диапазоне, таким как астрагалозид, углеводы, аминогликозиды и холестерин, часто служа в качестве дополнительного метода детекции к УФ- и флуоресцентным детекторам. Однако на результаты ELSD влияют множественные факторы, включая состав подвижной фазы, концентрацию органического растворителя, режим элюции и условия распыления. Поэтому для обеспечения точных и последовательных аналитических результатов важно оценить влияние этих факторов на результаты.
В данном исследовании, ссылаясь на аналитический метод для гидрохлорида спектиномицина из части II Фармакопеи 2025 года и руководствуясь принципами ICH QbD, был применен ортогональный экспериментальный дизайн для скрининга и оптимизации аналитических условий.

Рис. 1 Гидрохлорид спектиномицина

2. Прибор и метод

В этом исследовании хроматографический анализ проводился с использованием системы ВЭЖХ серии LC3200 производства Wayeal. Конфигурация прибора включала в себя кватернарный градиентный насос, автосамплер, колонку и детектор испарительного рассеяния света. Управление системой и сбор/обработка данных выполнялись с помощью хроматографического программного обеспечения SmartLab 2.0.

Таблица 1 Условия ВЭЖХ

3. Приготовление растворов

Раствор образца:Исходный раствор гидрохлорида спектиномицина был предоставлен клиентом с заявленной концентрацией 10 мг/мл и чистотой 99,8%.

0,1 М водный раствор трифторуксусной кислоты:Точно отмерьте 6,8 мл трифторуксусной кислоты в мерную колбу объемом 1000 мл. Доведите до метки очищенной водой и тщательно перемешайте. Наконец, отфильтруйте раствор под вакуумом через мембранный фильтр из целлюлозы с порами 0,45 мкм перед использованием.

Стандартные растворы:Исходный раствор разбавляли очищенной водой для приготовления растворов образцов с концентрациями 0,15, 0,25, 0,35, 0,50 и 0,70 мг/мл соответственно. Затем каждый раствор фильтровали через мембранный фильтр из целлюлозы с порами 0,45 мкм перед использованием.

4. Результаты и обсуждение

Китайская фармакопея использует идентичные хроматографические условия для анализа родственных веществ и содержания основного компонента в соответствии с записью о гидрохлориде спектиномицина. В методе указано, что «детектор может быть настроен в зависимости от фактических обстоятельств». В ходе исследования, учитывая инструментальные характеристики ELSD3260, требования аналитического метода и соответствующую литературу, был применен экспериментальный дизайн Плакетта-Бермана для скрининга нескольких экспериментальных параметров (таблицы 2 и 3). Впоследствии был использован дизайн Бокса-Бенкена (таблица 4) для оптимизации отклика площади пика детектора ELSD.

Таблица 2 Экспериментальный дизайн Плакетта-Бермана

Таблица 3 Анализ дисперсионного анализа (ANOVA) результатов эксперимента Плакетта-Бермана

Как видно из таблицы 3, скорость потока газа, скорость потока подвижной фазы и постколонная компенсация оказали отрицательное влияние. В частности, снижение скорости потока газа и скорости потока подвижной фазы, наряду с отключением постколонной компенсации, может увеличить отклик хроматографического пика. Однако снижение скорости потока подвижной фазы может привести к увеличению уширения пика и снижению чувствительности детекции. Поэтому скорость потока поддерживалась в соответствии со стандартным методом. Хотя температура колонки и температура детекции оказывали положительное влияние, они не значительно увеличивали значение отклика. Следовательно, последующие исследования будут сосредоточены на оптимизации скорости потока газа, температуры распылителя и температуры испарителя.

Влияние скорости потока газа, температуры распылителя и температуры испарителя на значение отклика было исследовано с использованием экспериментального дизайна Бокса-Бенкена в рамках методологии поверхности отклика. Экспериментальный дизайн представлен в таблице 4.

Таблица 4 Экспериментальный дизайн Бокса-Бенкена

Условия детекции для гидрохлорида спектиномицина были определены путем моделирования изменения площади пика с использованием методологии поверхности отклика (рисунок 2) и с учетом диапазонов параметров прибора: температура распылителя 85°C, температура испарителя 80°C, температура детектора 50°C и скорость потока газа 0,2 SLM.

A. Влияние скорости потока газа и температуры испарителя на площадь пика

B. Влияние скорости потока газа и температуры распылителя на площадь пика

C. Влияние температуры распылителя и температуры испарителя на площадь пика

Рис. 2 Изменение площади пика

Прецизионность инъекции

Исходный раствор гидрохлорида спектиномицина был разбавлен до концентрации 0,35 мг/мл, и было выполнено шесть последовательных инъекций в указанных хроматографических условиях с записью хроматограмм. Были рассчитаны относительные стандартные отклонения (RSD%) времени удерживания и площади пика для хроматографического пика гидрохлорида спектиномицина. Результаты показаны в таблице 5.

Таблица 5 Результаты теста прецизионности инъекции

Специфичность

В соответствии с руководством ICH Q2(R2) по валидации аналитических процедур и общим разделом Китайской фармакопеи 〈9101〉 Руководство по валидации аналитических методов, оптимизированный метод был валидирован на специфичность, линейный диапазон, точность и повторяемость.

Очищенная вода и раствор образца (0,35 мг/мл) были проанализированы параллельно с записью хроматограмм. Результаты (рисунок 3) показали отсутствие хроматографического пика при времени удерживания гидрохлорида спектиномицина в хроматограмме очищенной воды, в то время как пик для гидрохлорида спектиномицина в растворе образца достиг базового разделения от соседних пиков (R > 1,5).

Рис. 3 Аналитические результаты образца гидрохлорида спектиномицина (0,35 мг/мл)

Линейный диапазон

Приготовьте три параллельных образца исходного раствора гидрохлорида спектиномицина в соответствии с методом приготовления стандартного раствора, проанализируйте их в хроматографических условиях и запишите хроматограммы. Выполните регрессионный анализ, используя площади хроматографических пиков и соответствующие концентрации.

Рис. 4 Результаты теста на линейность (логарифмическое преобразование против непреобразованного)

В соответствии с литературой, взаимосвязь между значением отклика ELSD и концентрацией является нелинейной, требующей логарифмического преобразования как значения отклика, так и концентрации перед выполнением регрессионного анализа [8,9,10]. После применения логарифмического преобразования к экспериментальным данным коэффициент корреляции кривой линейной регрессии превысил 0,999, что значительно лучше, чем результат, полученный без логарифмического преобразования (как показано на рисунке 4).

Точность и повторяемость

Исходный раствор гидрохлорида спектиномицина был разбавлен до концентраций 0,25, 0,35 и 0,50 мг/мл. Для каждой концентрации было приготовлено три параллельных образца, проанализированы в указанных хроматографических условиях и записаны хроматограммы. Содержание было рассчитано с использованием кривой регрессии, и были оценены выход и повторяемость. Результаты представлены в таблице 6.

Таблица 6 Результаты теста на выход

Предел количественного определения (LOQ)

Разбавьте исходный раствор гидрохлорида стрептомицина до концентрации 12 мкг/мл. Проанализируйте образец в хроматографических условиях и запишите хроматограмму. Рассчитайте отношение сигнал/шум (S/N) хроматографического пика гидрохлорида стрептомицина и определите его повторяемость. Результаты показаны в таблице 7.

Таблица 7 Результат теста LOQ

Результаты показывают, что в соответствии с требованием руководства ICH S/N > 10, относительное стандартное отклонение площади пика для этой концентрации раствора гидрохлорида спектиномицина соответствует критериям. Поэтому он может служить стандартом количественного предела для гидрохлорида спектиномицина.

5. Заключение

Основываясь на методе фармакопеи, в этом исследовании была разработана надежная и устойчивая аналитическая процедура для количественного определения гидрохлорида спектиномицина. Условия детектора испарительного рассеяния света (ELSD) были систематически оптимизированы. Оптимизированный метод продемонстрировал улучшенную стабильность и точность, более высокую чувствительность детекции и удовлетворительный линейный диапазон.

Детектор ELSD3260 - это недавно разработанный и усовершенствованный низкотемпературный детектор с разделенным потоком. Он подходит для анализа как нелетучих, так и полулетучих веществ, обеспечивая ценную альтернативу для соединений, не имеющих УФ-поглощения. В этом исследовании использование ELSD3260 для анализа гидрохлорида спектиномицина привело к отличным значениям отклика и воспроизводимости, а также к повышению чувствительности детекции. Эти результаты показывают, что этот прибор хорошо подходит для количественного анализа гидрохлорида спектиномицина.