Остатки нитроимидазолов в свинине: метод Ваньи LCMS-TQ9200 LC-MS/MS, валидированный согласно GB 31658.23-2022
2026-10-21
Нитроимидазолы — синтетические антибактериальные и антипротозойные препараты, эффективно подавляющие анаэробные бактерии и трихомонады. Ранее они широко использовались в животноводстве и аквакультуре для борьбы с кишечными инфекциями и протозойными заболеваниями, повышая выживаемость. Однако исходные препараты и их метаболиты обладают выраженной токсичностью: они быстро метаболизируются в организме животных до нескольких активных метаболитов, некоторые из которых сохраняются в тканях гораздо дольше исходного соединения.
Токсикологические исследования показывают, что исходные нитроимидазолы и их основные метаболиты являются потенциально канцерогенными, мутагенными и генотоксичными. Остатки в продуктах животного происхождения попадают в организм человека через пищевую цепь, а длительное потребление в низких дозах может нарушать кроветворение, повреждать хромосомы и повышать риск мутаций генов. Поэтому Китай запретил нитроимидазолы в пищевых продуктах животного происхождения, и остатки в продуктах животного происхождения не допускаются, что делает точное тестирование остатков необходимым для безопасности пищевых продуктов.
GB 31658.23-2022, национальный стандарт безопасности пищевых продуктов для остатков нитроимидазолов в продуктах животного происхождения методом жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией, является законодательной основой данной работы. Он охватывает исходные препараты и метаболиты в говядине, баранине и других животных матрицах. Тестировочной лаборатории требовался валидированный рабочий процесс для свинины, охватывающий четыре целевых соединения — метронидазол, гидроксиметронидазол, диметридазол и гидроксидиметридазол — включая гидроксиметаболиты, которые труднее удерживаются и ионизируются, на уровне ниже ppb, с низким переносом и стабильной точностью при длительных последовательностях впрыскиваний.
| Наименование | Конфигурация |
|---|---|
| Система ЖХ-МС/МС | Тройной квадруполь Wanyi LCMS-TQ9200 |
| Аналитическая колонка | C18, 1,6 мкм, 2,1 x 100 мм |
| Подвижная фаза А | 0,1% муравьиной кислоты в воде |
| Подвижная фаза B | 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле |
| Скорость потока | 0,3 мл/мин |
| Температура колонки | 40 градусов C |
| Объем впрыска | 4 мкл |
| Вспомогательное оборудование | Ультразвуковая баня, вортексовый смеситель, высокоскоростная центрифуга, водяная баня, азотный испаритель, аналитические весы |
Взвесить 2 г образца (с точностью до 0,05 г) в центрифужную пробирку объемом 50 мл, добавить 10 мкл рабочей смеси внутреннего стандарта 1 мкг/мл, перемешать на вортексе в течение 30 секунд и оставить на 10 минут. Добавить 15 мл этилацетата, перемешать на вортексе в течение 2 минут и центрифугировать при 10 000 об/мин в течение 5 минут. Перенести супернатант и повторить экстракцию еще 15 мл этилацетата. Объединить оба экстракта и выпарить досуха под азотом в водяной бане при 25 °C.
Растворить остаток в 5 мл 0,1 моль/л соляной кислоты, перемешать на вортексе в течение 1 минуты, добавить 5 мл н-гексана, встряхивать в течение 1 минуты и центрифугировать при 5 000 об/мин в течение 5 минут. Отбросить гексановый слой и повторить обезжиривание еще 5 мл гексана. Кондиционировать картридж для твердофазной экстракции 3 мл 0,1 моль/л соляной кислоты и 3 мл метанола, загрузить водный слой, промыть 3 мл 0,1 моль/л соляной кислоты и элюировать 4 мл метанола. Выпарить элюат досуха при 35 °C под азотом, перерастворить в 0,5 мл воды, перемешать на вортексе в течение 1 минуты и профильтровать перед впрыскиванием.
| Параметр | Результат |
|---|---|
| Время анализа | Четыре аналита плюс внутренние стандарты разделены в течение 8 минут, симметричные пики, сильный отклик |
| Линейность | Калибровка с использованием матрицы при концентрациях 2, 4, 20, 40, 200 и 400 мкг/л; R2 выше 0,9995 для всех четырех соединений, отклонение ниже предела в 20% |
| ПДК и ПДКр | Отношение сигнал/шум выше 3 при 0,5 мкг/кг и выше 10 при 1 мкг/кг, что соответствует требованиям к ПДК 0,5 мкг/кг и ПДКр 1 мкг/кг |
| Точность (n = 6) | Относительное стандартное отклонение ниже 6% при 2 нг/мл и ниже 3% при 20 нг/мл, при пределе в 10% |
| Перенос | Впрыскивание бланка после верхнего стандарта 400 нг/мл значительно ниже 20% площади пика ПДКр |
| Восстановление при добавлении | От 61,8% до 103,35% при 2 нг/мл и от 104,35% до 107,15% при 20 нг/мл, в пределах требования от 60% до 120% |
| Реальный образец свинины | Ни один из четырех нитроимидазолов не обнаружен |
Калибровка с использованием матрицы в экстракте свинины без аналитов компенсирует подавление ионов мясной матрицей и обеспечивает надежную количественную оценку на следовом уровне. Форма пиков была хорошей, без хвостов, что подтверждает, что экстракция этилацетатом, обезжиривание гексаном и очистка методом ВЭЖХ удаляют интерференции при 1 мкг/кг.
Система ЖХ-МС/МС Wanyi LCMS-TQ9200 обеспечила валидированный метод определения четырех остатков нитроимидазолов в свинине в соответствии с GB 31658.23-2022. Симметричные пики, R2 выше 0,9995, точность в пределах 10%, незначительный перенос и восстановление в пределах от 60% до 120% демонстрируют, что рабочий процесс соответствует рутинным качественным и количественным требованиям для скрининга и подтверждения запрещенных ветеринарных препаратов и обеспечивает надежную техническую основу для мониторинга рисков безопасности пищевых продуктов.
- Приобретение MRM в режиме тройного квадруполя обеспечивает селективность, необходимую для подтверждения запрещенных остатков на уровне 0,5 мкг/кг в жирной мясной матрице.
- Химия C18 с размером частиц менее 2 мкм на колонке 2,1 мм при скорости 0,3 мл/мин разделяет четыре аналита менее чем за 8 минут при низком потреблении растворителя.
- Внутренние стандарты, меченные изотопами, корректируют потери при экстракции и ВЭЖХ, стабилизируя результаты между партиями.
- Обезжиривание гексаном перед ВЭЖХ защищает картридж и аналитическую колонку, продлевая срок службы в лабораториях с высокой пропускной способностью по анализу остатков.
